Successivamente alla caduta dell'Impero, Padova vide il Brenta cambiare di corso con la rotta del 589, sostituito dal Bacchiglione. Venne quindi assediata e completamente rasa al suolo nel 601 dai Longobardi di Agilulfo che, secondo la tradizione locale, penetrarono nelle difese cittadine dall'attuale Ponte della Morte davanti a via Rudena (ovvero: rovina). Monselice resistette qualche mese prima di capitolare anch'essa ai Longobardi. Alcuni abitanti cercarono allora rifugio nella Laguna Veneta, contribuendo successivamente alla nascita di quella che diverrà, secoli dopo, Venezia.

Nel 899 Padova fu razziata dagli Ungari.

Solo dopo l'anno 1000 Padova iniziò a riprendersi, affermandosi come comune indipendente, pur dovendo subire le devastazioni del terremoto del 1004, ancor più grave, quello del 1117, così come il grande incendio del 1174. Nel 1164 partecipò alla lega veronese contro Federico Barbarossa. Dal 1168 (convegno di Lodi) al 1183 (Pace di Costanza) Padova fu membro anche della Lega Lombarda.

Gli anni successivi videro Padova espandere la propria importanza ed i propri domini, in perenne lotta contro i comuni limitrofi. Nel 1222 venne fondata l'Università, la seconda più antica d'Italia ed una tra le prime e più prestigiose d'Europa. Vi predicò Sant'Antonio, che vi morì nel 1231 e per il quale i padovani eressero una grandiosa basilica. Tra il 1303 ed il 1305 Giotto dipinse la Cappella degli Scrovegni, inestimabile tesoro pittorico. L'espansione del comune patavino fu tuttavia interrotta a più riprese, in particolar modo tra il 1237 ed il 1256 dalla sanguinosa dominazione di Ezzelino IV Da Romano, ricordato per aver trucidato in un solo giorno oltre diecimila padovani.

Nel 1318 muta l'assetto politico a Padova: inizia la Signoria dei Carraresi con l'elezione a Capitano del Popolo di Jacopo da Carrara. Il secolo successivo, pur turbato da continue lotte con le signorie limitrofe e con la minacciosa Venezia, fu per Padova l'apice del suo splendore, assoluta protagonista dell'arte e della cultura europea grazie alla presenza di artisti e letterati quali Giusto De' Menabuoi, Guariento, Altichiero, Francesco Petrarca. Nel 1405 Padova dovette però piegarsi definitivamente a Venezia dopo una lunga e cruenta lotta.

Durante il medioevo il municipio e la successiva signoria scavarono le principali opere idrauliche della provincia di Padova: il canale di Battaglia, il Piovego e il Brentella.