Nel 49 AC divenne nominalmente municipio romano, perdivenirlo poi effettivamente nel 45 AC con la Lex Julia Municipalis. Durante la dominazione romana Patavium, com'era allora conosciuta, divenne una delle più ricche città dell'Impero grazie, tra le altre cose, all'allevamento di cavalli. In età augustea Padova divenne parte della X Regio che aveva come capitale Aquileia, cui era collegata grazie alla via Annia che partiva da Adria. Del periodo romano rimangono alcuni ponti, rimaneggiati in età medioevale, l'arena (presso la cappella Scrovegni), resti di terme (sotto palazzo Storione) e del foro (zona piazza Garibaldi e piazzetta Cavur) di cui rimane una sola colonna. All'inizio del V secolo a Padova fu posta un Praefectus Sarmatarum gentilium, ovvero una delle 13 guarnigioni di Sarmati a difesa dell'impero. Probabilmente la guarnigione era di stanza a Sarmeola (Sarmaticula), frazione di Rubano e a Sermazza (località di Vigonovo). Nel 452-453 la città fu devastata dall'invasione degli Unni di Attila. Dal 535 al 553 imperversò la guerra tra Bisanzio e i Goti alleati dei Franchi.